近日，澳门永利yl6776海洋学院马翠萍教授团队在病原体RNA快速检测、提高核酸检测特异性领域取得新进展。相关成果以“Engineering of a chimeric template triggers RNase H-based isothermal amplification approach for sensitive detection of pathogen RNA”和“Boron nitride nanoplate-based improvement of the specificity and sensitivity in loop-mediated isothermal amplification for Vibrio parahaemolyticus detection”为题目分别发表在国际知名期刊《Analytical Chemistry》（中科院一区Top）（doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04098）和《Analytica Chimica Acta》（中科院一区Top）（doi.org/10.1016/j.aca.2023.341851）上。论文第一作者分别为海洋学院第五层次引进人才李勇副教授和研究生张鑫，以及研究生蔺硕，两项成果通讯作者均为马翠萍教授，澳门永利yl6776为第一单位和唯一通讯单位。
病原体的准确检测对于临床诊断和生物医学研究具有重大的意义，基于DNA检测聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）技术作为病原体检测的金标准，具有高灵敏、高特异性的优点，但存在无法区分病原体生存状态的问题；相比之下，RNA具有半衰期短、丰度高的特点，基于RNA的检测可以选择性地检出具有转录活性的病原体。针对病原菌的高灵敏、快速检测问题，马翠萍教授团队构建出一种新型等温RNA检测技术，该技术基于DNA/RNA嵌合探针触发指数扩增反应，检测结果可以通过便携式紫外灯即可进行判读，且无需精密的温度控制装置（图1）。另外，该技术可以实现靶标RNA区域的短期保护，即使在RNA酶存在的条件下，该技术至少可以保证36小时内RNA不会发生降解，避免了由于靶标降解造成的假阴性问题。该平台对于大肠杆菌RNA的检测限为1 fg/μL, 对于牛奶中大肠杆菌的检测限为1.0×102 CFU/mL，检测过程40分钟之内即可完成，不依赖于复杂的检测设备，有望成为临床诊断和食品安全检测领域强有力的RNA检测工具。
图1 基于RNase H的等温指数扩增方法示意图
此外，以DNA扩增为基础的核酸检测已广泛用于分子诊断、食品安全监测和传染病预防。然而，引物二聚体的形成、发夹结构和错配杂交导致的非特异性扩增严重限制核酸检测技术的实际应用。因此，迫切需要探索一种提高核酸检测的特异性和灵敏度的方法。马翠萍教授团队证明了纳米材料氮化硼纳米片（Boron Nitride Nanoplate, BNNP)，由于其独特的表面性质，可以与扩增反应的主要组分，如单链引物和Bst DNA聚合酶相互作用，并提高溶液的导热性，BNNP的存在显著提高了PCR和环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal Amplification, LAMP）的特异性（图2）。此外，BNNP还提高了LAMP的灵敏度，并且基于BNNP的LAMP的检出限比传统LAMP低两个数量级，同时此方法被证实可用于海产品中副溶血性弧菌的检测。这是首次系统地证明BNNP可以提高PCR和LAMP扩增反应的效率和准确度，从而极大地扩展了核酸检测在实验室和现场环境中的应用。
图2 BNNP提高核酸扩增方法特异性和灵敏度的原理图
